分子生物學(xué)筆記 第三章 基因表達(dá)的調(diào)控

第三章 基因表達(dá)的調(diào)控 基因表達(dá)：DNA→mRNA→蛋白質(zhì)的遺傳信息傳遞過程基因表達(dá)的調(diào)控 第一節(jié) 基因的活化 基因的“開關(guān)”-染色質(zhì)的活化一、活性染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)間期核染色質(zhì)：異染色質(zhì)(heterochromatin)，高度壓縮(不轉(zhuǎn) 錄)；常染色質(zhì)(euchromatin)，較為松散， 常染色質(zhì)中約10%為活性染色質(zhì)(更開放疏松)?；钚匀旧|(zhì)→←非活性染色質(zhì)二、活性染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) (一)DNaseI敏感性 轉(zhuǎn)錄活性(或有潛在轉(zhuǎn)錄活性)的染色質(zhì)對DNase I更敏感． DNase I超敏感位點(diǎn)(DNase I HyperSensitive Sites，DHSS) (二)組蛋白H3的CyS110上巰基暴露，三、活性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成（一)、核小體位相(Phased positioning) 1．核小體的旋轉(zhuǎn)定位(rotational positioning) 指核小體核心與DNA雙螺旋在空間結(jié)構(gòu)中的相互關(guān)系，主要包括DNA雙螺旋的大溝是面向還是背向核心結(jié)構(gòu)． ‘ 2．核小體的平移定位(translational positioning) 指核小體與特定DNA序列的結(jié)合位置和方式，特別是轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的DNA調(diào)控元件（啟動子、增強(qiáng)子等）序列與核小體的相互位置關(guān) 系。 (二)、組蛋白修飾 1．H1組蛋白磷酸化促進(jìn)染色體包裝，影響轉(zhuǎn)錄活性， 2．核心組蛋白修飾乙酰化：常發(fā)生在組蛋白的Lys，一般活性染色質(zhì)是高度乙?；摹＃ㄈ?HMG蛋白結(jié)合 HMG（high mobility group)蛋白―高遷移率蛋白, 如HMG14/HMG17. 與核小體核心顆粒結(jié)合，有利轉(zhuǎn)錄。四、DNA甲基化與基因表達(dá) ． (一)、真核生物基因組DNA的甲基化(Methylation) 哺乳動物基因組中5%的C為甲基化(m C)，mC主要存在于CpG二核苷酸中． CpG二核苷酸序列常成簇聚集并零散地分布于人基因組中，形成CpG島(CpG islands)．人基因組中約每10Kb就有一個CpG島． CpG島常與基因相連(可作為尋找基因的標(biāo)記)。 (二)DNA甲基化的轉(zhuǎn)錄抑制作用?；虮磉_(dá)與甲基化呈負(fù)相關(guān)基因甲基化狀態(tài)： 1、高度甲基化： 基因?yàn)槌掷m(xù)失活(如女性的一條X染色體； 2、誘導(dǎo)去甲基化：如組織或發(fā)育階段特異性表達(dá)基因； 3、持續(xù)低水平甲基化：具有轉(zhuǎn)錄活性(如持家基因)。持家基因(housekeeping gene)： 是指對所有類型組織細(xì)胞在任何時候都需要其表達(dá)的基因，通常都是維持細(xì)胞基本生存所必須的基因，其表達(dá)常保持在固定的水平。又稱 為組成性基因(Constitutive gene)。（三）甲基化與基因組印跡基因組印跡(genomic imprinting)：指基因表達(dá)活性只局限于來自雙親之一的基因版本。被印跡(imprinted)的基因．基因組印跡的機(jī) 制--DNA高度甲基化基因組印記與腫瘤． 第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控中最重要的環(huán)節(jié)。一、真核基因轉(zhuǎn)錄基本條件：特異性基因轉(zhuǎn)錄的基本條件包括： ①啟動子(特別是核心啟動子) ②轉(zhuǎn)錄模板(轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（+1）---終止點(diǎn)) ③RNA PolⅡ ④普通轉(zhuǎn)錄因子(GTFs) (一)啟動子(promoter) 與基因轉(zhuǎn)錄啟動有關(guān)的一組DNA序列，一般位于RNA poII轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游100-200bp以內(nèi)，其功能是決定轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)和調(diào)控轉(zhuǎn)錄頻率．啟動子區(qū)域包括核心啟動子和啟動子上 游近側(cè)序列： 1、核心啟動子(core promoter) 是決定轉(zhuǎn)錄起始位置的關(guān)鍵序列，也是普通轉(zhuǎn)錄因子TFⅡD的結(jié)合位點(diǎn)， ①TATA盒(TATA box) 位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-25～-30bp． ②起始子(initiator，Inr) Inr是與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)重疊的短的較保守序列．注：①不是所有基因都含有TATA盒或Inr序列．有的只有其中之一，有的兩者都 無． ②這些核心啟動子的序列和它們之間的間隔多變 2、上游啟動子元件(Upstream Promoter element，UPE) 位于較上游(-30一-110bp)，能較強(qiáng)影響轉(zhuǎn)錄起始的頻率，如CAAT 盒和GC盒．其中GC盒是轉(zhuǎn)錄因子SPl的結(jié)合位點(diǎn)。 (二)RNA聚合酶Ⅱ 負(fù)責(zé)真核生物蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄(產(chǎn)物mRNA)，有7-10個亞基，最大亞基的羧基末端結(jié)構(gòu)域(CTD)具有7個氨基酸(Ty r-Ser-Pro-Thr-Ser -Pro-Set)的重復(fù)序列，其中有多個磷酸化位點(diǎn)．CTD磷酸化對調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄有重要作用． (三)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子(basal transcription factor) 真核基因轉(zhuǎn)錄除RNA聚合酶外還需要許多蛋白因子―轉(zhuǎn)錄因子參加，其中一些轉(zhuǎn)錄因子是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始必需的，并且可以維 持基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄，因此稱為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子或普通轉(zhuǎn)錄因子(general transcription factor) 1．RNA聚合酶 II的普通轉(zhuǎn)錄因子(TF II) 包括TFIID,TFⅡB,TFIIF，TFIIE，TFIIH，TFIIA等． TFIID是由TATA盒結(jié)合蛋白(TATA binding protein，TBP)和8種TBP協(xié)同因子(TBP associated factor，TAF)組成的復(fù)合物，TFIID可識別和結(jié)合核心啟動子(TATA盒和Inr)； TFⅡB的C端與TFIID和DNA的復(fù)合物結(jié)合，N-端與TFⅡF協(xié)同作用募集RNA聚合酶II，再加上TFIIE,TFII H形成完整的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物． TFIIH有蛋白激酶活性，可使RNA Pol最大亞基CTD磷酸化，使轉(zhuǎn)錄起始過渡到轉(zhuǎn)錄延伸． TFIIA有助于TFIID與TATA盒核心啟動子結(jié)合． 2、TAF的作用 TFIID中包括至少8種TBP協(xié)同因子,分子量為30―250kD,分別命名為TAFⅡ-30～250． TAFⅡ150識別起始子(1nr)序列． TAF是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的輔助因子，它的作用是通過與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（激活物或阻遏物）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活或 抑制。二、基因轉(zhuǎn)錄的順式調(diào)控元件順式調(diào)控元件(cis-regulating element)是指對基因表達(dá)有調(diào)控活性的DNA序列，其活性只影響與其自身同處于一個DNA分子上的基因．順式調(diào)控元件中的 短核心序列：共有序列或一致序列（consensus sequence)。 (一)啟動子(promoter) (二)增強(qiáng)子(enhancer) 能顯著提高基因轉(zhuǎn)錄效率的一類順式調(diào)控元件（其核心序列常為8-12bp)．增強(qiáng)子的作用特點(diǎn)： 1．能(通過啟動子)提高同一條鏈上的靶基因轉(zhuǎn)錄速率； 2．增強(qiáng)子對同源基因或異源基因同樣有效； 3．增強(qiáng)子的位置可在基因5’-上游、基因內(nèi)或3’下游序列中； 4．自身沒有5’-或3’-方向性； 5．增強(qiáng)子可遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(最多30Kb)； 6．增強(qiáng)子一般具有組織或細(xì)胞特異性． (三)負(fù)調(diào)控元件―沉寂子 負(fù)調(diào)控元件是能抑制基因表達(dá)的序列．如沉寂子(silencer) (四)其它順式調(diào)控元件 1．應(yīng)答元件(responsive elements) 真核細(xì)胞中對某些特定的環(huán)境作出應(yīng)答的基因，常具有相同的順式元件―應(yīng)答元件．應(yīng)答元件能被在一些特定情況下表達(dá)的調(diào)控因子識別 (又稱為可誘導(dǎo)的順式調(diào)控元件／反式作用因子)。 2．轉(zhuǎn)座元件對基因表達(dá)的調(diào)控， 。三、基因轉(zhuǎn)錄的反式作用因子轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要是通過與多種DNA元件結(jié)合的蛋白因子來實(shí)現(xiàn)．反式作用因子(trans-ac ting factor)是通過識別和結(jié)合順式調(diào)控元件的核心序列而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的一組蛋白質(zhì)．反式作用因子對基因表達(dá)的調(diào)控可正( 激話)可負(fù)(阻遏)． (一)反式作用因子的結(jié)構(gòu)： 結(jié)構(gòu)域(domain)是指蛋白質(zhì)中可以具有獨(dú)立的超二級結(jié)構(gòu)的部分。通常由一個基因外顯子編碼，并可具有特定的功能。在較大的 蛋白質(zhì)中， 多個結(jié)構(gòu)域間可通過較短的多肽柔性區(qū)互相聯(lián)接．基序(motif)：一般指構(gòu)成任何一種特征序列的基本結(jié)構(gòu)．作為結(jié)構(gòu)域中的亞單 元，其功能是體現(xiàn)結(jié)構(gòu)域的多種生物學(xué)作用． 1．反式作用因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain)中的幾種常見基序： ①螺旋/轉(zhuǎn)角/螺旋（Helix-turn-helix,HTH）基序兩段螺旋被一短的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)分開，其中一段螺旋為DNA識別 螺旋．同源異形結(jié)構(gòu)域(Homeodomain，由同源異形盒編碼)中含有HTH基序。具有Homeodomain的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋 白在胚胎發(fā)育和正常細(xì)胞分化的基因表達(dá)調(diào)節(jié)中有重要作用。 ②鋅指(Zinc finger)基序由肽鏈的保守序列中的一對組氨酸加一對半胱氨酸(His2／Cys2)或2對半胱氨酸(cys2／cys2) 與一個鋅離子形成配位鍵，這些氨基酸對之間的多膚鏈成環(huán)狀突出并折迭成指形結(jié)構(gòu)，多個指結(jié)構(gòu)常串聯(lián)重復(fù)。鋅指族轉(zhuǎn)錄因子以二聚體 形式同DNA上的順式調(diào)控元件結(jié)合。含鋅指基序的轉(zhuǎn)錄因子：與GC盒結(jié)合的SPl、類固醇激素受體家族，抑癌蛋白WT1等。 ③亮氨酸拉鏈(Leucine-Zipper)基序由一段每隔6個a a 就有一個Leu的伸展肽鏈組成，這些周期性出現(xiàn)的Leu都位于α―螺旋的同―側(cè)面，因此兩條均含Leu拉鏈基序的蛋白質(zhì)通過亮氨 酸側(cè)鏈的相互作用形成二聚體。具有亮氨酸拉鏈基序的轉(zhuǎn)錄因子：原癌基因C-Jun/C-fos(APl家族) ④螺旋-環(huán)-螺旋(Helix-loop-Helix，HLHt)基序．由2個α螺旋間隔一個非螺旋的環(huán)(loop)組成．如原 癌基因產(chǎn)物C-myc及其結(jié)合蛋白Max．含HLH和Leu-拉鏈基序的轉(zhuǎn)錄因子的相似性： ①均至少含有一個α螺旋，其中都有一側(cè)親水面和一側(cè)疏水面，因此這兩種基序又稱為兩親α―螺旋基序． ②兩類轉(zhuǎn)錄因子均依靠α螺旋氨基端附近的堿性區(qū)（帶正電荷aa區(qū)）與DNA結(jié)合，因此又分別稱為bzip和bHLH （b=basic，堿性) ③兩類轉(zhuǎn)錄因子活性都依賴于二聚體化 2、反式激活結(jié)構(gòu)域(Transactivation domain) ‘ 是反式作用因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域，一般由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的30-100個aa組成．常見的反式激活域有以下幾種： ①酸性α謹(jǐn)螺旋結(jié)構(gòu)域(acidic a-Helix domain)如Jun； ②富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域(glutamine―rich domain)如SPl． ⑧富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域(proline-rich domain)。 (二)反式作用因子家族同一類序列特異性轉(zhuǎn)錄因子一般由基因家族編碼，它們的蛋白結(jié)構(gòu)同源，并結(jié)合特異的順式調(diào)控元件，這些蛋白 組成一個反式作用因子家族。 1．POU家族這一家族中都有一個獨(dú)特的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域-POIJ結(jié)構(gòu)域． POU結(jié)構(gòu)域包括： N端POU特異結(jié)構(gòu)域(POUs)+C端POU同源異形結(jié)構(gòu)域(POUH）． POU結(jié)構(gòu)域是Pit1，octl／oct2和unc86等反式作用因子共有的保守區(qū)，因此這類蛋白統(tǒng)稱為POU結(jié)構(gòu)域蛋白。 2、類固醇激素受體家族包括：糖皮質(zhì)激素受體(GR），性激素受體(ER／AR)，甲狀素激素受體 (TR)，維甲酸受體(RAR)，VitD3受體(VD3R)．這些受體位于胞質(zhì)或核內(nèi)，通過激活基因轉(zhuǎn)錄起作用．這些受體的D NA結(jié)合結(jié)構(gòu)域都含有2個Cys2／Cys2型鋅指基序，(分別由2個外顯子編碼)，可識別DNA上的激素應(yīng)答元件(HRE：H ormone responsive elements) 3、NF-κB家族 包括RelA(P65)，P60，RelB，C-Rel，P50五種．主要是P50／RelA異二聚體．胞質(zhì)中P50／RelA •Iκ B抑制蛋白(失活狀態(tài))→釋放Iκ B而被激活→易位至核內(nèi)→激活轉(zhuǎn)錄。

 第三節(jié) 轉(zhuǎn)錄后加工在細(xì)胞核內(nèi)對基因產(chǎn)物(mRNA前體)進(jìn)行各種修飾、剪接和編輯，使編碼蛋白質(zhì)的外顯子部分連接成為一個連續(xù)的開放讀 框(open reading frame，ORF)的過程稱為轉(zhuǎn)錄后加工．一、mRNA前體加工的分子機(jī)制 - 核內(nèi)mRNA前體―異質(zhì)性核RNA(heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)， hnRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核異質(zhì)性核糖核蛋白(hnRNP), mRNA前體的加工在hnRNP上進(jìn)行． (一)5’-端加帽(capping) ―mRNA前體的5’-端加甲基化鳥苷(m7pppN) 5’端m7G帽子結(jié)構(gòu)的作用： 1．使mRNA更穩(wěn)定 2．增加蛋白質(zhì)合成的效率 3．帽子結(jié)構(gòu)對mRNA前體的剪接是必需的（二)3’-端接多聚腺苷(poly(A)) ―在mRNA前體3’端接上一個約200―250個腺嘌呤核苷酸(A)的尾巴。 poly(A)尾巴的作用： 1．有利于mRNA通過核孔； 2．參與穩(wěn)定mRNA； 3．增強(qiáng)翻譯效率。（三)mRNA前體的剪接剪接(sp!icing)―剪除內(nèi)含子，并將外顯子連接 1．真核內(nèi)含子的序列特征：真核內(nèi)含子總是由Gu開始，以AG結(jié)束，內(nèi)含子的5’-端剪接點(diǎn)(供位)和3’-端剪接點(diǎn)(受位)， 以及內(nèi)含子中的一個內(nèi)部序列分支點(diǎn)（branch site)是mRNA前體正確剪接所必需的。 2．mRNA前體的剪接機(jī)制 -剪接過程由二步連續(xù)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)組成．該過程中產(chǎn)生一個套索狀中間體（ lariat intermediate)，結(jié)果使2個原先被分隔的外顯子連接。 3．剪接體(spliceosome) 細(xì)胞核內(nèi)的小分子RNA(一般≤300堿基)―SnRNA（small nuclear RNA)，包括U1―U6等。 snRNA與特異的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物-SnRNP．mRNA前體與snRNP形成的復(fù)合物―剪接體．mRNA前體的剪接通過剪接 體進(jìn)行。 U2，U6，U4／U6 SnRNP等是活性剪接體的主要成份． (四)RNA編輯(RNA editing) 是一種與mRNA剪接不同的加工方式，指mRNA在轉(zhuǎn)錄后因插入、缺失或核苷酸的替換，改變了DNA模板來源的遺傳信息，從而翻 譯出氨基酸序列不同的多種蛋白質(zhì)， RNA編輯的例子：apo―B的編輯：C→U替換。二、內(nèi)含子的選擇性剪接選擇性剪接(alternative splicing)：在mRNA前體的剪接過程中，參加剪接的外顯子可以不按其線性次序剪接，內(nèi)含子也可以不被切除而保留，即一 個外顯子或內(nèi)含子是否出現(xiàn)在成熟mRNA中是可以選擇的，這種剪接方式稱為選擇性剪接。此外，不同的啟動子或不同的poly(A )加尾位點(diǎn)的選擇，也可看作選擇性剪接．選擇性剪接的主要方式。由來自一個基因的mRNA前體因選擇性剪接而產(chǎn)生多種mRNA， 并翻譯出的不同蛋白質(zhì)，稱為同源異構(gòu)體(isoform)． >5%的人基因可在不同的組織或生理狀態(tài)下，通過選擇性剪接產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體，這是造成真接生物高度異質(zhì)性的基礎(chǔ)。

 第四節(jié) 翻譯水平調(diào)控 一、翻譯起始因子(IF)的調(diào)節(jié)：可逆磷酸化的作用． 1．eIF-4F的磷酸化激活蛋白質(zhì)的合成． 2．eIF-2的磷酸化引起翻譯起始受阻，降低蛋白質(zhì)的生物合成水平二、mRNA結(jié)構(gòu)與翻譯控制 ，（一)5’-UTR結(jié)構(gòu) 1、mRNA5’端m7G帽有增強(qiáng)翻譯水平的作用． 2、“上游AUG密碼子”(位于起始AUG上游的其他AUG密碼子)的存在往往抑制下游開放讀框的翻譯效率． 3、起始AUG旁側(cè)序列對翻譯效率的影響．Kozak序列：GCCAUGG (二)3’-UTR結(jié)構(gòu) 1．poly(A)尾增加翻譯效率 2．富含UA序列抑制翻譯。三、mRNA穩(wěn)定性與翻譯控制 mRNA穩(wěn)定性主要取決于3’―UTR結(jié)構(gòu) 1．poly(A)尾增加mRNA穩(wěn)定性， 2．3’-UTR中UA序列導(dǎo)致mRNA不穩(wěn)定．四、翻譯后修飾 1、 氨基酸側(cè)鏈的共價修飾：乙?；?、磷酸化、糖基化（N-、O-）； 2、 蛋白質(zhì)前體的切割和成熟。Proprotein→protein.例：胰島素的成熟。五、蛋白質(zhì)的分泌和胞內(nèi)定位信號肽：作為蛋 白質(zhì)定位信號的短肽序列，指導(dǎo)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)秸_位置，定位結(jié)束后通常被特異的信號肽酶切除。常見幾種信號肽的特點(diǎn)： 1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞分泌信號：N-端約20個左右氨基酸，疏水。 2 線粒體定位信號：N-端，一面為正電殘基另一面為疏水殘基的兩親α螺旋。 3 核定位信號：內(nèi)部，常為堿性氨基酸加脯氨酸鏈兩部分構(gòu)成。如SV40 T 抗原：pro-lys-lys-lys-Arg-lys(127-132)